在組織中研究多種蛋白質的空間位置關系，尤其是在三維組織中，在相當多的生物醫學研究中都有非常重要的意義。但是熒光多重標記技術存在諸多限制，并且目前能實現多重標記的方法都只支持使用薄的組織切片（<100μm）。這篇文章的研究者利用了受激拉曼光譜成像檢測光譜比較窄，不易產生信號串擾的優點，在透明化組織成像中引入了特殊的地中海拉曼探針，對厚達1mm的組織進行了一次性多靶標成像。
受激拉曼顯微技術檢測光譜比較窄、信號不容易產生串擾，但是其信號比傳統的熒光信號強度弱，常規方法很難檢測到。研究者結合電子預共振光譜（electronic pre resonance spectroscopy）和受激拉曼顯微技術（Stimulated Ramen Scattering microscopy）,可以使染料的拉曼吸收截面增加1013倍，彌補了拉曼信號弱、很難檢測的缺點。研究者設計了地中海拉曼檢測探針（MARS）結合優化的透明化技術（rDISCO: Raman 3D imaging of solvent -cleared organs），達到了在1mm厚的組織上11種靶標的同時成像。 
首先，研究者設計了地中海拉曼探針MARS。MARS探針使用π形連接的三鍵產生電子放大，可以使染料的拉曼吸收截面增加1013倍，彌補了拉曼信號弱、很難檢測的缺點。在生物細胞中MARS受激拉曼檢測光譜為1800-2300cm-1。因為所有的透明化試劑在2000-2400cm-1光譜范圍內都不產生信號，所以沒有背景。NHS Ester是常用可以和探針結合的活性基團，已知有4種已經連接了NHS Ester 的MARS探針，研究者新研發了另外四種與NHS Ester 連接的MARS探針，它們和已知的四種地中海拉曼探針在核心原子、環狀結構數量、與氮原子的結合方式上存在差異。圖1顯示了它們的化學結構和光譜特性。

圖 2 c tubulin成像 d 免疫熒光和SRS圖像的比較 g 薄腦片的12種靶標同時成像。
Fluorescence: DNA (DAPI), vesicular glutamate transporter 1 (VGluT1-Alexa Fluor 488, glutamatergic neurons, direct immunolabeling), tyrosine hydroxylase (TH-Alexa Fluor 594, dopaminergic neurons, direct immunolabeling) and F-actin (Phalloidin-Alexa Fluor 647); epr-SRS: neuronal nuclei (NeuN; neurons, MARS2228), α-tubulin-MARS2176 (direct immunolabeling), calbindin (CB;
Purkinje neurons, MARS2145), β-III-tubulin (TUBB3; neurons, MARS2200), wheat germ agglutinin (WGA; MARS2242), GABA (γ-aminobutyric acid) B receptor 2 (GABBR2; GABAergic neurons, MARS2212), myelin basic protein (MBP; oligodendrocytes, MARS2188) and GFAP (astrocytes and neural stem cells, MARS2159).
使用這些MARS探針和抗體結合后，可以對組織內不同的蛋白質進行成像。與傳統的免疫熒光圖像類似（圖2c）。這種方法可用于石蠟和冰凍組織切片的成像。將MARS探針連接lectin就可以看到細胞的膜結構，因為探針的檢測光譜很窄，只有12 cm-1，這樣就可以實現多個不同的拉曼探針同時成像。因此，研究者在小鼠腦切片上標記了12種marker（8種MARS和4種熒光，圖2g）,可以識別出腦片中的不同細胞，包括神經元顆粒細胞、星形膠質細胞、單樹突細胞等。

圖3 各種透明化方法的SRS成像效果，其中uDISCO方法的信號最好

圖4  Volumetric immuno-eprSRS imaging with uDISCO clearing.
a, Volume-rendered image of NeuN (granular neurons) labeled with C-cored MARS2228 in 500-μm-thick cerebellum sections cleared by uDISCO. Single-plane images show good epr-SRS contrast along the whole depth. b, One-shot eight-target volume-rendered images of a 500-μm-thick mouse cerebellum section by RADIANT. A typical workflow for tissue sample preparation, staining and clearing is depicted; Ab, antibody. Fluorescence: LEL (Lycopersicon esculentum lectin DyLight 488), TO-PRO-3 (TO-PRO; cell nucleus stain); epr-SRS: NeuN (MARS2228), TUBB3 (MARS2200), MBP (MARS2176), GABBR2 (MARS2145), WGA (MARS2242) and GFAP (MARS2159). c, Representative single-plane images with zoom-in images at z = 250 μm from the 3D data set in b; scale bars, 100 μm.
研究者還測試了不同的組織透明化方法 scale S、FOCM、Ce3D、3DISCO、 uDISCO等方法對于40-100μm厚組織切片的成像效果，發現uDISCO的成像效果好（圖3）。并且一次對8種目標（6種MARS探針和兩種熒光）進行了同時成像（圖4b）。
研究者還發現了透明化組織SRS成像最重要的影響因素，就是MARS探針在透明液中會產生降解。因此減少其降解，例如降溫到4度或者在透明液中加入DPE和VIT E等還原劑就可以提高成像效果。研究者對一系列透明化方法進行了優化和篩選，最終發現BABB-D4+1%PG在4度下成像的效果佳，并將這種方法命名為rDISCO （Raman 3D imaging of solvent -cleared organs）。在100μm的組織中，rDISCO成像的信噪比是uDISCO的2.6倍。

圖5 Volume-rendered images of GFAP (astrocytes, labeled with MARS2145) and MBP (oligodendrocytes, labeled with Alexa Fluor 488) in 1-mm-thick cerebellum sections cleared by rDISCO. Two-color merged single-plane images show good epr-SRS and fluorescence contrast along the whole depth. g, Zoomed-in, volume-rendered images of GFAP (labeled with MARS2145) in 1-mm-thick cerebellum sections cleared by rDISCO. h, Single-plane images of g at 500-μm depth show fine spatial resolution to resolve fibral structures of astrocytes .Left, zoom-in to the regions outlined by the dashed white box.1-mm-thick samples (n = 3 ROIs).
用這種方法在1mm厚的腦片上實現了11個靶標的3D大樣本深度成像，如圖6。

圖6 RADIANT with rDISCO clearing enables millimeter-scale, highly multiplexed protein imaging.
Eleven-target volume-endered images of a 1-mm-thick mouse cerebellum section by RADIANT with rDISCO clearing. Fluorescence: concanavalin A (ConA, Alexa Fluor 350), Griffonia simplicifolia lectin (GS-II, Alexa Fluor 488), TUBB3 (Alexa Fluor 594, direct immunolabeling), TO-PRO (cell nucleus stain); epr-SRS: NeuN (MARS2228), LEL(MARS2200), MBP (MARS2176), GABBR2 (MARS2145), WGA (MARS2242), vimentin (Vim, MARS2212) and GFAP (MARS2159).
 
這項研究結合了電子預共振光譜（electronic pre resonance spectroscopy）和受激拉曼顯微技術（Stimulated Ramen Scattering microscopy），利用特殊設計的MARS探針和優化的組織透明化方法實現了在1mm腦片的11種靶標的一次性成像。這項技術在未來的生物醫學上會有非常廣闊的應用前景。
Leica STELLARIS CRS 系統是一套方便快捷的多模態受激拉曼光譜成像系統，商品化的受激拉曼成像系統，無需為了保證光路的正確而花很多時間去調整它，您可以專注于生物學成像，系統同時兼顧了受激拉曼成像、單光子、多光子、二次諧波、三次諧波成像，對于上述的組織三維多靶標受激拉曼成像是非常適合的研究工具。